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Rev. Hosp. Psiquiátrico de la Habana 2008, 5(2)

ARTICULOS ORIGINALES

ESTUDIO EXPERIMENTAL EN RATAS INOCULADAS INTRACEREBRALMENTE CON LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO DE PACIENTES ESQUIZOFRÉNICOS

Segundo Mesa Castillo1

RESUMEN

Se hace un estudio mediante técnicas inmunoelectromicroscópicas en cerebros de cuatro ratas descendientes de padres inoculados intracerebralmente con el líquido cefalorraquídeo (LCR) de una paciente esquizofrénica hebefrénica, comparando sus resultados con un estudio en ratas controles. En un estudio anterior se habían encontrado alteraciones compatibles con la etiología por el herpes simplex hominis tipo I (HSV-1) en el cerebro de adultos esquizofrénicos, en  fetos abortados utilizando la misma técnica de investigación, así como en embriones de pollo inoculados con LCR de pacientes esquizofrénicos. Los resultados obtenidos hasta el momento en este estudio pueden constituir un elemento más en favor de la transmisión de tipo vertical planteada para la enfermedad, así como su relación con el virus HSV-1. Estudios recientes en sueros obtenidos durante el embarazo de madres cuyos hijos padecieron esquizofrenia orientan hacia una etiología viral de la enfermedad y constituyen un elemento confirmatorio  de la teoría del neurodesarrollo sobre la  adquisición de la enfermedad antes del nacimiento por factores ambientales en el segundo trimestre de embarazo donde el herpes simplex se encuentra entre los candidatos más importantes.

Palabras clave: esquizofrenia, inmunoelectromicroscopia, inoculación en ratas, líquido cefalorraquídeo, virus herpes simple.

INTRODUCCIÓN

En 1979 se reportó por Tyrrell y colaboradores que el LCR del 35 % de pacientes esquizofrénicos tenia efectos citopáticos cuando era inoculado en fibroblastos de embrión humano.1. Sin embargo, este hallazgo no era especifico para la esquizofrenia, ya que el LCR de pacientes con trastornos afectivos producía igual efecto citopático en igual proporción. Se desconoce aún si este efecto se debía a una toxina o a un virus. La imposibilidad de trasmitir este efecto citopático de cultivo a cultivo y su persistencia a pesar del uso de inhibidores de la síntesis proteica y de DNA o RNA, sugería más la posibilidad tóxica que virológica a menos que se tratara de una forma viral no convencional.

En 1983 Baker reportó los resultados de la inoculación intracerebral a monos de la América del Sur con el LCR que había producido efectos citopáticos en cultivos de tejidos.2 Este autor señaló alteraciones de conducta en una parte de los animales inoculados que se caracterizaban por disminución de la actividad normal y cambios en la conducta social que semejaban los síntomas del defecto esquizofrénico; por el contrario, la inyección de LCR que no producía efectos citopáticos no provocaba tales alteraciones de conducta.

Al estudiar la descendencia de animales inoculados, en algunos se encontraron anomalías congénitas: defecto del cierre del cráneo con encefalocele y cambios en la coloración de la cola. De estos resultados se consideró la posibilidad de que las malformaciones encontradas fueran el resultado de una infección viral persistente o crónica en los padres inoculados. Esto estaba sustentado además, en que el efecto citopático se relacionaba regularmente con partículas de 30 a 60 nm de diámetro cuando se usaron filtros de membrana de celulosa para el filtrado del LCR.

En trabajos experimentales en animales hemos reportado alteraciones electromicroscópicas en el cerebro de embriones de pollo inoculados con el LCR de una paciente esquizofrénica hebefrénica cuyo feto abortado había sido estudiado con igual técnica. En los embriones de pollo inoculados se encontraron, en el sistema nervioso, alteraciones similares a las encontradas anteriormente en el feto.3-5

En un intento de reproducir en forma experimental los elementos que sustentan la hipótesis de la transmisión de tipo vertical de la enfermedad, utilizamos el mismo LCR con el que habíamos inoculado los embriones de pollo inoculándolo en el cerebro de ratas para estudiar su descendencia. Los resultados de este trabajo son los que se exponen a continuación.

MÉTODOS

Mediante trepanación de cráneo utilizando una fresa estomatológica, se inocularon intracerebralmente en el hemisferio cerebral izquierdo, dos ratas Wistar, hembra y macho, de 5 semanas de edad y de 150 g de peso, con 0,1 cc de LCR de la paciente esquizofrénica hebefrénica L.M.S. (Feighner et al.).6 Dos meses después se aparearon las ratas inoculadas y se esperó el tiempo de gestación hasta el nacimiento de la descendencia. De esta se seleccionaron 4 ratas, las 2 primeras de 8 días de nacidas, de 9,9 g (distrófica) y 13,9 g de peso respectivamente. Una semana después se seleccionaron 2 ratas de 15,9 g y 30,6 g, la primera distrófica. Los controles N = 2, de 6 días de nacida y 16,2 g de peso y 19 días de nacida con 32,2 g de peso. Todas las ratas se registraron con los números del 1 al 6, 1, 2, 4 y 5, las ratas de padres inoculados y 3 y 6, las ratas controles. En todos los casos, después de la trepanación del cráneo, se realizó toma del hemisferio izquierdo y fijación inmediata del tejido cerebral en glutaraldehído-paraformaldehído al 1 % durante 1 hora a 4 ºC. Las muestras así obtenidas, se trasladaron a los laboratorios de microscopia electrónica del Centro Nacional de Investigaciones Científicas y al Departamento de Patología del Instituto de Nefrología, donde fueron procesadas mediante las técnicas inmunoelectromicroscópicas ya descritas en trabajos anteriores.7 Los cortes de los bloques fueron examinados en los laboratorios de microscopia electrónica de los centros antes citados y en el laboratorio de microscopia electrónica del hospital "Hermanos Ameijeiras". El trabajo de inoculación de las ratas, su observación, así como la obtención de las muestras, se realizó en el Departamento de Embriología del Instituto de Ciencias Médicas de Cuba y en el bioterio del propio instituto.

RESULTADOS

De las 4 ratas descendientes de padres inoculados, solamente en una, la de menor peso, se observó la presencia de partículas en el núcleo de neuronas, semejantes a formas viralesinmaduras, quereaccionaron ligeramente con el anticuerpo para el HSV-1. El diámetro de dichas partículas osciló entre 40 y 60 nm, las que aparecían en grupos con simetría en su disposición (figura 1). No se observó el fenómeno de replicación de membranas, ni la localización de dichas partículas fuera del núcleo, como se ha reportado en trabajos anteriores.

 

Fig. 1. Muestra la presencia de partículas esféricas que reaccionaron ligeramente con anticuerpo HSV1. Rata descendiente de padres inoculados. Bar 100 nm.

 

Un análisis digital permitió destacar las partículas del resto de la preparación (figura 2). La frecuencia de aparición también fue menor en relación con los estudios en cerebros de esquizofrénicos adultos, donde en ocasiones se pudo observar una distribución similar de las partículas dentro del núcleo de neuronas (figura 3).

 

 

Fig. 2. El análisis digital permitió resaltar las partículas [en amarillo- flecha] en relación al resto de la preparación [en azul y verde].

 

Figura 3:  Se muestra la presencia de partículas intranucleares que semejan formas virales inmaduras de 80-100 NM de diámetro equivalente en muestras del núcleo amigdalino de un paciente esquizofrénico joven fallecido [flecha].

 

En observaciones hechas en un feto de madre esquizofrénica hebefrénica (figura 4), la reacción antígeno-anticuerpo fue mucho más intensa que la observada en la rata descendiente de padres inoculados, con una distribución de las partículas en forma similar a la observada en otro feto de madre esquizofrénica paranoide sin el uso de anticuerpos (figura 5). En las ratas controles no se observó ninguna alteración.

  Figura 4: Se muestran  partículas esféricas de igual diámetro marcadas con anticuerpo anti-HSV1 [flechas]

                                

Figura 5:Partículas intranucleares en un feto monocigótico de madre esquizofrénica paranoide. Tamaño de  las partículas 100 nm [flecha]


DISCUSIÓN

En 1988 reportamos cambios neurológicos y encefálicos macroscópicos y microscópicos en embriones de pollo inoculados con el LCR de una paciente esquizofrénica hebefrénica cuyo feto había sido estudiado mediante técnicas inmunoelectromicroscópicas. En este estudio se habían observado en las neuronas y células endoteliales, partículas y cuerpos de inclusión que reaccionaban con el anticuerpo para el HSV1.7 Posteriormente reportamos hallazgos similares en un estudio a doble ciegas con mayor cantidad de muestras de un número de pacientes. En este último estudio se realizó un análisis computarizado de las partículas, lo que nos permitió identificar la estructura de estas, así como realizar las mediciones de sus distintos componentes. Este estudio nos sirvió además, para confirmar la hipótesis que habíamos planteado anteriormente de la relación de las partículas con las membranas celulares y la multiplicación aumentada de estas membranas observada en cerebros de adultos esquizofrénicos, en su descendencia y en embriones de pollo inoculados con el LCR de pacientes esquizofrénicos.8 En estas observaciones la similitud encontrada entre el feto de la madre esquizofrénica hebefrénica y los adultos esquizofrénicos estudiados, hizo que consideráramos este hallazgo como un elemento más en favor de la transmisión de tipo vertical de la enfermedad, lo que nos motivó a tratar de reproducir en forma experimental la posible sucesión de acontecimientos biológicos que pueden ocurrir en este tipo de transmisión. Para ello realizamos la inoculación directa del LCR de pacientes esquizofrénicos en el sistema nervioso central de animales de experimentación con el objetivo de estudiar posteriormente su descendencia. El neurotropismo del herpes virus es un hecho que se había demostrado, así como la presencia de DNA de este tipo de virus en el núcleo amigdalino de pacientes esquizofrénicos9-14 demostrado mediante técnicas de hibridización. Un aumento significativo de anticuerpos neutralizantes en el suero de estos pacientes y en el LCR nos permitió considerar la inoculación de LCR de pacientes esquizofrénicos en animales de experimentación, como un método posible para reproducir en forma experimental la enfermedad o un equivalente neuropatológico de esta, por la acción directa del virus en el sistema nervioso, su multiplicación y la posible transmisión a la descendencia. La presencia de partículas virales en las neuronas de una de las ratas estudiadas –de todas las nacidas, la de menor peso– y las características morfológicas de estas partículas, similares a las observadas en los estudios anteriores, es un aspecto que se debe considerar en esta investigación tratándose de una enfermedad en la que se plantea la transmisión de tipo vertical, sin descartar la contaminación ocasional por el HSV1 en el laboratorio o su presencia en el sistema nervioso en condiciones normales.

Otro aspecto que se debe tener en cuenta es que la transmisión a la descendencia se relacione con los cambios inmunológicos que la enfermedad produce en las poblaciones linfocitarias y en las linfoquinas y, por ende, en los animales inoculados, y no se deba a una transmisión directa del virus. Estos cambios inmunológicos no se limitan al número de poblaciones o subpoblaciones de linfocitos, sino que se relacionan además con cambios en su actividad funcional, cambios en la producción de interleukinas y presencia de autoanticuerpos.15-18

Un mecanismo patogénico en la esquizofrenia puede ser el resultado de una infección viral en etapas tempranas de la vida que actuara junto a predisponentes genéticos sobre el sistema inmunológico con la consiguiente liberación de linfoquinas como la interleukina 10 que tiene entre otras propiedades la posibilidad de actuar sobre las membranas celulares y de producir cambios de conducta, lo cual se ha demostrado en trabajos experimentales en ratas inoculadas y en su descendencia.19

La posibilidad de que el hallazgo de partículas virales en la descendencia de ratas inoculadas no se relacione con la etiología de la enfermedad se debe tener en cuenta, dada la posible presencia de formas latentes del HSV-1 en animales, incluyendo al hombre en condiciones normales.

No obstante todas las consideraciones planteadas  se destaca la necesidad de continuar estos estudios en mayor cantidad de animales y con inóculos que procedan de pacientes con distintas formas clínicas de la enfermedad y en distintos períodos evolutivos, con el objetivo de establecer posibles relaciones que permitan un mejor conocimiento del posible rol de los virus en la etiología de la esquizofrenia.

Hemos observado partículas virales en fetos de madres esquizofrénicas estudiados durante el segundo trimestre de vida fetal (por razones médicas fue necesario interrumpir el embarazo). Estos hallazgos confirmarían lo planteado en la teoría del neurodesarrollo en la etiología de la esquizofrenia donde se plantea que el origen de esta enfermedad se debe a la influencia de agresiones al feto por alteraciones medioambientales en el útero, entre las que se destacan los virus. Estudios recientes han demostrado aumento de anticuerpos contra el virus herpes simplex en sueros de madres gestantes cuyos hijos posteriormente padecieron esquizofrenia lo que habla a favor de una posible interacción entre factores genéticos y medioambientales. Estos resultados y la vinculación de factores genéticos, inmunocitoquinas y HSV-120-22 hacen que se considere este virus entre los principales candidatos en la etiología de la esquizofrenia.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a las compañeras técnicas de microscopia electrónica María Cristina de la Rosa, Magaly Pujada y María Elena Ramos, su valiosa colaboración técnica.

EXPERIMENTAL STUDY ON INTRACEREBRAL INOCULATED RATS WITH CEREBROSPINAL FLUID TAKEN FROM SCHIZOPHRENIC PATIENTS

SUMMARY

A study is made by means of immuno-electron microscopic techniques in brains of four descending rats of parents inoculated intra-cerebrally with the cerebrospinal fluid (CSF) of a hebephrenic schizophrenic patient comparing its results with a study in control rats. In a previous study we have found alterations compatible with herpes simplex hominis type I (HSV1) virus etiology in the brain of schizophrenic adults, in aborted fetuses using the same research technique, as well as in chicken embryos inoculated with CSF from schizophrenic patients. The results obtained up to present in this study can constitute a further element favoring the vertical type transmission outlined for the illness as their relationship with HSV-1. Recent studies in serums obtained during pregnancy of mothers whose adult offspring suffered schizophrenia guide toward a viral etiology of the illness and they constitute a confirmatory element of the neurodevelopment theory about the acquisition of the illness before the birth due to environmental factors during the second pregnancy trimester where herpes simplex are among the most important candidates.

Key words: schizophrenia, immuno-electron microscopy, rats’ inoculation, cerebrospinal fluid, herpes simplex virus.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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  8. Mesa CS. Inoculación de embriones de pollo con líquido céfalo-raquídeo de pacientes esquizofrénicos. Estudio inmuno-electromicroscópico. WPA Educational Section. Available at http://www.wpanet.org/education/wpaeln3.html, Mayo, 2005.

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1 Especialista de II Grado en Neurología. Hospital Psiquiátrico de La Habana.

 

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