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Rev. Hosp. Psiquiátrico de la Habana 2009, 6(2)

 

ALTERACIONES MITOCONDRIALES EN EL CEREBRO DE UN GEMELO MONOCIGÓTICO DE UNA MADRE ESQUIZOFRÉNICA

Segundo Mesa Castillo 1

RESUMEN

La etiología de la esquizofrenia es aún muy poco conocida, sin embargo hay cada vez más evidencias que la caracterizan como resultado de factores genéticos y ambientales que impactan sobre el cerebro en el período prenatal. La discordancia de esquizofrenia en gemelos genéticamente idénticos sugiere un mecanismo no genético o uno que comprende la interacción del genotipo y el medio ambiente en el período prenatal. Al final del cuarto mes de vida del feto tiene lugar un crecimiento significativo y crítico de un derivado del ectodermo, el cerebro. Se han identificado distintos factores de riesgo ambientales que pueden afectar el cerebro en este período: malnutrición del feto, hipoxia e infecciones virales. La habilidad para examinar directamente estos posibles agresores es limitada en los estudios en humanos. El desarrollo del cerebro prenatal no está abierto a un escrutinio directo. En nuestros estudios de microscopia electrónica de cerebros de fetos de madres esquizofrénicas hemos observado, dentro de los núcleos de las neuronas, la presencia de partículas virales incompletas. Otro importante aspecto de estas observaciones fue la presencia de alteraciones mitocondriales en uno de los fetos de una pareja de gemelos monocigóticos de una madre esquizofrénica paranoide. Este trabajo se relaciona con estos hallazgos teniendo en cuenta el interés cada vez mayor en los últimos años del papel de las mitocondrias en esta enfermedad.

Palabras clave: esquizofrenia, mitocondria, microscopia electrónica, virus, fetos.

INTRODUCCION

Hay dos aspectos del desarrollo que pueden estar implicados en la patogénesis de la esquizofrenia: a) La presencia de factores no presumiblemente genéticos (desarrollo inestable) y b) cualquier daño experimentado durante el desarrollo. Los daños que están asociados con el período crítico del desarrollo del cerebro son los que más probablemente se vinculen con el desarrollo de la esquizofrenia. La discordancia de esquizofrenia en gemelos genéticamente idénticos sugiere un mecanismo no genético o un mecanismo en el que participen factores genéticos y medioambientales.  Una exposición diferenciada a tales factores de riesgo temprano puede contribuir al fenómeno de discordancia en los trastornos psicóticos. La hipótesis de que los virus causen esquizofrenia y otros trastornos neurológicos fue propuesta en el siglo XVIII y aún es aceptada como una de las asociaciones más comunes1 (revisión de Yolken & Torrey 1995).
En muchos estudios la infección por el virus de la influenza y la fiebre, particularmente durante el segundo trimestre de embarazo, han sido implicadas como factores en el desarrollo de esta condición.2,3 Sin embargo, estudios recientes han mostrado falta de evidencia de invasión directa del feto por el virus de la influenza. Una invasión directa del embrión o del feto es poco probable que sea la causa. Aunque se han encontrado evidencias serológicas de infección por el virus de la influencia en mujeres cuya descendencia ha padecido esquizofrenia, no hay evidencias microbiológica ni histopatológica de que el virus haya infestado el feto en estos casos.4 Una presuntiva evidencia de etiología viral de la esquizofrenia requiere de la demostración del virus, el antígeno o de anticuerpos virales.
En trabajos anteriores hemos obtenido resultados que constituyen una evidencia directa en 2 de 3 de estos requerimientos, virus y antígeno:

  1. en estudios post mortem del cerebro de pacientes esquizofrénicos adultos jóvenes,
  2. en el cerebro de animales experimentalmente inoculados con líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes esquizofrénicos,
  3. en el lóbulo temporal de fetos de madres esquizofrénicas.

Hasta nuestro reciente reporte, las evidencias que sustentaran el concepto de interacción virus-célula en la hipótesis del neurodesarrollo de la esquizofrenia habían sido indirectas. Las partículas virales nunca habían sido demostradas. En nuestros estudios de fetos de madres esquizofrénicas también hemos observado anomalías estructurales en las mitocondrias. En los últimos años las mitocondrias han sido objeto de estudio en la esquizofrenia por diferentes investigadores. Los virus se pueden localizar en las mitocondrias e irrumpir en su integridad. De esta forma, su acción, en cooperación con otros productos celulares, ya virales o inducidos, es capaz de comprometer la funcionalidad de las membranas mitocondriales de las células infectadas. El presente trabajo se relaciona con nuestros hallazgos en el lóbulo temporal en uno de dos fetos gemelares monocigóticos procedentes de una madre esquizofrénica paranoide con fuertes antecedentes familiares de esquizofrenia. La presencia de anomalías estructurales de las mitocondrias ha sido el objeto de este artículo.

MATERIAL Y MÉTODO

Previo consentimiento informado se obtuvieron muestras de la punta del lóbulo temporal de dos fetos gemelos masculinos, (monocigóticos, monocoriónicos y biamnióticos), de 16 semanas de tiempo de gestación, abortados por indicaciones médicas, de una madre esquizofrénica paranoide. Uno de los gemelos presentaba criptorquidismo. Las muestras, una vez obtenidas, se fijaron en glutaraldehído-paraformaldehído y fueron transportadas al laboratorio de microscopia electrónica para la realización de las técnicas de microscopia electrónica: técnica general para microscopia electrónica de transmisión e inmuno-electromicroscopia. Las muestras obtenidas se fijaron durante 1 hora en glutaraldehído-paraformaldehído, se lavaron en buffer fosfato (PBS) durante 5 minutos en cada lavado. Posteriormente se procedió al bloqueo de la peroxidasa endógena con metanol más peróxido de hidrógeno durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Se realizó el  lavado con varios volúmenes de PBS durante 15 minutos. Lavados con TRIS, 3 volúmenes de 5 minutos cada vez. Se utilizó suero normal de carnero diluido 1:5. Se añadió el antisuero anti-herpes simplex hominis tipo (HSV1) durante 24 horas y se lavó posteriormente con TRIS (3 volúmenes, 5 minutos cada uno. Se añadió DAB (diamino-bencidina), durante 8 minutos a temperatura ambiente y se lavó con TRIS. Se realizó la posfijación con tetróxido de osmio al 1 % durante 30 minutos, y se lavó con buffer fosfato (3x15 minutos), etanol al 30 % durante 5 minutos, al 50 % durante 5 minutos, al 70 % durante 10 minutos y etanol absoluto (3x20 minutos). Óxido de propileno (3x15 minutos): se procedió a la inclusión en Epon I durante 60 minutos, Epon II durante toda la noche, y se terminó la inclusión definitivamente para bloques con dilución del antisuero 1/10 y 1/20, bloques controles de cada dilución, bloques de los controles más control de los bloques controles en cada dilución y técnica general.

RESULTADOS

En uno de los fetos estudiados (el que presentaba criptorquidismo) se observó dentro del núcleo de las neuronas la presencia de partículas esféricas vacías de 100 nm que ocupaban el centro de un área electrón lúcida (Fig. 1).

Fig. 1 Partículas virales incompletes [flecha blanca] dentro del núcleo de una neurona de un feto gemelar monocigótico de una madre y abuela esquizofrénica paranoide.

Las inclusiones con partículas aparecieron en número de 2 a 8 por núcleo, con gran incidencia en su aparición. El tamaño y la forma de las partículas coincidieron con las observaciones hechas de partículas similares en el cerebro de adultos esquizofrénicos fallecidos, en otros fetos estudiados (Fig. 1A, 1B, 1C, 1D, 1E) y en animales experimentamente inoculados con LCR de pacientes esquizofrénicos utilizando las mismas técnicas electromicroscópicas.

En el estudio inmunoelectromicroscópico se observó una reacción positiva contra el virus herpes simplex hominis tipo I en el núcleo y en el citoplasma de las neuronas (Fig. 2). Las partículas virales no se observaron en el resto de las células del sistema nervioso, tampoco la reacción inmunológica.

Fig. 2. Partículas virales incompletas (flechas blancas) e intracitoplasmáticas completas (flechas negras) marcadas con anticuerpo para el virus anti-herpes simplex hominis tipo I unido a peroxidasa. Ax = axon. Feto monocigótico

Mitocondria. Se observó un número incrementado de mitocondrias en el citoplasma de las neuronas correspondientes a la capa granular de la corteza temporal (Fig. 3).

Fig. 3. Neurona granular con el citoplasma completamente lleno de mitocondrias gigantes, la mayor parte vacías de crestas.

 Las mitocondrias afectadas mostraron pérdida de las membranas internas, lo que da la apariencia de mitocondrias vacías. Se observaron dentro de las mitocondrias partículas semejantes a virus esféricos. (Fig. 4).

   Fig. 4 Partículas en brote  dentro de las mitocondrias semejantes a virus esféricos [flecha].

Una reacción antígeno-anticuerpo se observó en algunas mitocondrias cuando se usó el antisuero antiherpes simplex hominis tipo I Fig. 5. Estas anomalías estructurales observadas en las mitocondrias fueron observadas solo en el feto afectado.

Fig. 5 Reacción antígeno anticuerpo dentro de las mitocondrias [flechas]. Técnica de inmuno-peroxidasa. Anticuerpo de conejo antiherpes simplex hominis tipo I. Feto gemelar de madre y abuela esquizofrénica paranoide.

Estas anomalías estructurales en las mitocondrias fueron observadas solo en el feto afectado. El feto no afectado no presentó ni partículas virales en el núcleo ni alteraciones en el citoplasma (con relación a las mitocondrias (Fig. 6).

 Fig. 6. Núcleo normal en una neurona del lóbulo temporal del feto monocigótico gemelar no afectado.

DISCUSIÓN

Las evidencias acumuladas en la última década sugieren el rol de la disfunción mitocondrial en la patogénesis de la esquizofrenia, del trastorno bipolar y de otras enfermedades psiquiátricas;5 sin embargo no hay estudios de las mitocondrias mediante técnicas de microscopia electrónica. La mayor parte de los estudios han utilizado métodos indirectos en la búsqueda de disfunción mitocondrial en la esquizofrenia y los trastornos bipolares. Entre estos métodos se destaca la cuantificación total del DNA mitocondrial y la depleción normal con resultados contradictorios.6,7 La mayor parte de estos estudios se limitaron a la corteza frontal.8
En relación con métodos de análisis directo hay pocas publicaciones. Los únicos estudios de microscopia electrónica que ofrecieron detalles en la ultraestructura del sistema nervioso en la esquizofrenia comenzaron en la década del 70. Casi todos los estudios de embriones de madres esquizofrénicas fueron realizados por investigadores rusos,9,10 los que destacaron en ellos las alteraciones encontradas en cerebros de embriones en diferentes estadios de evolución, desde 7 hasta 12 semanas.
Las características de los cambios celulares en los cerebros de embriones consistieron en un mayor desarrollo del sistema de membranas. Las alteraciones mitocondriales fueron muy evidentes con aumento en su número y tamaño, y destrucción de las crestas. Estos investigadores señalaron también la presencia de estructuras laminares a las que denominaron “lamelosomas”.11,12
Las alteraciones mitocondriales han sido interpretadas como parte de un proceso general de alteraciones de membrana en la esquizofrenia.13 Los lamelosomas y la proliferación de membranas han sido observados en nuestros estudios en adultos esquizofrénicos, en embriones inoculados con LCR de pacientes esquizofrénicos y en el sistema nervioso de fetos de madres esquizofrénicas14 (Fig. 7).

figura7

Fig. 7. Lamelosomas. Estructura laminar frecuentemente vista en estudios electromicroscópicos de embriones y fetos de madres esquizofrénicas, en adultos esquizofrénicos y en animales experimentalmente inoculados con líquido cefalorraquídeo de pacientes esquizofrénicos.

El rol fisiopatológico de las alteraciones mitocondriales en la esquizofrenia pudiera estar relacionado no solo con el proceso oxidativo sino también con el sistema de conducción celular debido al compromiso de las membranas. Los virus pueden interactuar con las mitocondrias. Hay diversos reportes en este sentido.15-18 La mayor parte se relacionan con el virus herpes. Particularmente el virus herpes simplex elimina el DNA mitocondrial.19 Nosotros hemos observado partículas y antígeno de herpes simplex en las 3 experiencias ya citadas: adultos esquizofrénicos, animales inoculados y fetos de madres esquizofrénicas.20 La hipótesis del neurodesarrollo en la etiología y fisiopatología de la esquizofrenia se considera una de las más consistentes en estos momentos.21 Se basa en una serie de evidencias que guían hacia una afectación del feto en el período crítico del desarrollo del ser humano causada por complicaciones del embarazo y del parto, particularmente relacionadas con un impacto presunto o conocido sobre el desarrollo neurológico del feto, que resulta en un incremento del riesgo de psicosis esquizofrénica. Entre los posibles candidatos etiológicos de impacto están las infecciones virales. Un virus actuando en este importante y crítico estadio de desarrollo, interactuando o no con factores genéticos, puede ser responsable de la cascada de eventos biológicos que aparecen posteriormente y pudiera explicar el período de relativa quietud que existe entre el nacimiento y la aparición de los síntomas en la pubertad lo que pudiera estar relacionado con la reactivación de una infección viral latente. Los hallazgos del presente trabajo son compatibles con una infección viral activa del sistema nervioso central por el virus herpes simplex hominis tipo I (HSV1) durante el segundo trimestre de embarazo en uno de los dos fetos estudiados. Hasta nuestro reciente reporte las evidencias que sustentaran el concepto de interacción virus-célula en la hipótesis del neurodesarrollo en la esquizofrenia habían sido indirectas. Las partículas virales nunca habían sido demostradas. Este trabajo es la primera evidencia directa de la presencia de partículas virales en el sistema nervioso central en fetos de madres esquizofrénicas en el período crítico del segundo trimestre de desarrollo fetal. La importancia de este hallazgo puede tener aplicaciones prácticas en la prevención de la enfermedad si se tiene en mente su relación directa con la etiología y fisiopatología de la esquizofrenia.
Se sugiere la posibilidad de estudiar las células del líquido amniótico por medio de técnicas virológicas o de microscopia electrónica en mujeres con riesgo de tener una descendencia de esquizofrenia con el objetivo de aplicar medidas preventivas (interrupción del embarazo o tratamiento antiviral temprano), si se demuestra una infección viral en las células del líquido amniótico en estadios tempranos del neurodesarrollo.

BRAIN MITOCHONDRIAL ALTERATIONS IN A SCHIZOPHRENIC MOTHER’S MONICIGOTIC TWIN

SUMMARY

The aetiology of schizophrenia is still poorly understood, but there are increased evidences that characterize the disorder as a consequence of genetic and environmental factors that impact on brain development in the prenatal period. The fact that genetically identical twins can be discordant for schizophrenia strongly suggests a nongenetic mechanism or a mechanism involving an interaction of genotype and environment in the prenatal period. At the end of the fourth foetal month, a significant and critical growth and development of one ectodermal derivative, the brain, is taking place. Several environmental risk factors have been identified to affect the brain in this period that includes foetal malnutrition, hypoxia and viral infection. The ability to direct examine these putative aggressors is limited in human studies. Prenatal brain development is not open to direct scrutiny. In our electron microscopic studies of brain of foetuses from schizophrenic mothers we have observed within the nuclei of neurons the presence of incomplete viral particles. Other important aspects of these observations were the presence of structural mitochondria alterations in one of a monozygotic twin pair from a paranoid schizophrenic mother. The present work is related to this finding considering the increased interest about the role of mitochondria in this disease in the last years.

Key words: schizophrenia, mitochondria, electron microscopy, virus, foetus.

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1 Especialista de 2do Grado. Neurólogo. Hospital Psiquiátrico de la Habana, Cuba.

 

 

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